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    酶聯免疫檢測試劑盒抗體的酶標記方法及標記效果測定

    發布時間:2021-12-18   點擊次數:214次
      今天小編給大家講講酶聯免疫檢測試劑盒抗體的酶標記方法及標記效果測定:
     
      1.標記方法 良好的酶結合物取決于兩個條件:即高效價的抗體和高活性的酶??贵w的活性和純度對制備標記抗體至關重要,因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。
     
      酶與抗體交聯,常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行,標記效果好,特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為:將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4℃冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml,混勻并裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(或過夜)使之結合,然后吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小時,將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30分鐘后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,并對之透析過夜(4℃),次日離心除去不溶物,即得到酶標抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進行測定后,冷凍干燥或低溫保存。
     
      2.酶標抗體標記效果測定:測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
     
      (1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線,經PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時,將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,如果出現應有的顏色反應,再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結合物在顯色后,瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫檢測試劑盒)方法進行方陣滴定,此法不僅可以測定標記效果,還可以確定酶標抗體的使用濃度。
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